home
user-header

                        
                        
SHERLOCK отыщет мутации на уровне РНК
15 апреля 2017 г., 15:20 73

Американские ученые разработали быстрый и недорогой метод высокоточной детекции нуклеиновых кислот на основе системы CRISPR-Cas13a. Статья опубликована в журнале Science.

Кадр из сериала «Шерлок» (BBC)


 

Cas13a — бактериальная эндонуклеаза, способная распознавать специфическую последовательность РНК и разрезать схожие нити, расположенные поблизости. Функционально этот фермент аналогичен Cas9, который рассматривается как один из наиболее перспективных способов редактирования генома. По сравнению с последней, Cas13a обладает рядом отличий: во-первых, она вносит в целевую молекулу не разрыв, но полностью уничтожает ее, а во-вторых, работает на уровне РНК (Cas9 рассчитана на ДНК). Эти свойства делают Cas13a неподходящей для геномного редактирования, однако позволяют использовать в иных целях.

 

В новой работе сотрудники Массачусетского технологического института и других учреждений испытали возможности новой системы. Для этого Cas13a патогенной бактерии Leptotrichia shahii инкубировали с репортерной РНК, целевой РНК (ssRNA 1) и CRISPR РНК (crRNA). В кассете последней при этом были закодированы фрагменты ssRNA 1 — она служит для нуклеазы «шпаргалкой» при поиске мишени. Анализ показал, что система хорошо справляется с детекцией in vitro, однако для достижения аттомолярной чувствительности авторам потребовалось подобрать оптимальные условия предварительной амлификации (увеличения нуклеиновых кислот). Нужного уровня точности удалось достичь путем рекомбиназной полимеразной амплификации (увеличения числа копий ДНК).

 

Схема работы SHERLOCK. После конвертации ДНК в РНК в «библиотеке» последней находят мишень с помощью CRISPR-Cas13a, несущей эталон целевой последовательности. Разрушение РНК приводит к флуоресценции (Изображение Jonathan S. Gootenberg et al., Science, 2017)

 

После конвертации ДНК в РНК Cas13a детектировал целевую последовательность, сравнивая ее с закодированной в CRISPR, и разрезал другие РНК. Нуклеаза также уничтожила репортерную РНК — на обнаружение мишени указывала флуоресценция поврежденной молекулы. Методы цифровой капельной полимеразной цепной реакции (ПЦР) — одного из основных способов детекции нуклеиновых кислот — подтвердили, что для работы новой системе необходима только одна молекула ДНК или РНК. При этом, по сравнению с традиционными техниками, она обладает меньшей вариабельностью результатов при многократных повторах.

 

Эффективность системы, получившей название SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing), тестировалась на лентивирусах, которые содержали фрагменты вируса лихорадки денге и вируса Зика. Согласно результатам, SHERLOCK различал патогены и детектировал их частицы при концентрации не более двух аттомоль. Также метод успешно испытали на сыворотке крови, образцах слюны и мочи с содержанием нуклеиновых кислот порядка трех аттомоль, при этом очистка последних не влияла на чувствительность системы. С помощью искусственных мутаций авторы показали, что SHERLOCK справляется даже с распознаванием однонуклеотидных полиморфизмов (SNP): так, он оказался способен различить четыре человеческих образца по пяти локусам из геномной базы данных. На последнем этапе система справилась с регистрацией 0,1-процентного уровня нуклеиновой кислоты с раковыми мутациями.

 

По мнению исследователей, SHERLOCK может использоваться для генотипирования геномов, мониторинга наследственных заболеваний и патогенных мутаций. Стоимость одного теста с помощью новой техники (на стекловолокнистой бумаге) составит при этом около 61 цента.

 

Подробнее о генной инженерии с помощью CRISPR читайте в нашем материале.

 

Naked Science

#естественные_науки, #медицина

Нравится
  • 15 апреля 2017 г., 17:28

    Тем не менее болезней все больше и больше... Новые технологии находят больше и больше бактерий в человеке

     
    • 15 апреля 2017 г., 18:46

      Руфь, на эту тему была гипотеза, что разнооборазие болезней связано с количеством людей и продолжительностью жизни. По теории вероятности риск заболеть увеличивается. 

       
      Автор
      • 15 апреля 2017 г., 19:20

        Сур Бере, ... Каждый родившийся несёт новые болезни? Причём чем дольше живёт, тем больше...