home
user-header

                        
                        
Боковой амиотрофический склероз вылечили на уровне клеток
16 августа 2017 г., 11:43 419

Молекулярные биологи из Университета Калифорнии в Сан Диего (США) на основе технологии CRISPR/Cas9 разработали метод устранения транскрипов «паразитной» РНК. Накопление такой РНК связано с развитием множества тяжелых заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз, миотоническая дистрофия мышц, болезнь Хантигтона и т.д. Ученым удалось испытать новый метод пока только на отдельных клеточных линиях, однако результаты исследований выглядят достаточно перспективно с точки зрения терапии этих до сих пор неизлечимых заболеваний. Статья исследователей опубликована в журнале Cell.

Wikimedia Commons


 

Микросателлиты — это участки генома, представляющие собой множественные повторы коротких (менее 9 букв) нуклеотидных «фраз», вроде (CTG)n, (CCTG)n и т.д.. Они составляют значительную часть всего генома человека и часто рассматриваются в качестве так называемой мусорной, то есть не выполняющей никаких осмысленных функций ДНК. Подобные повторы встречаются как вне, так и внутри генов (прежде всего в некодирующих участках, интронах), они имеют тенденцию быстро изменяться (увеличиваться или уменьшаться) от поколения к поколению, что, например, используется в генетике для установления родства между близкими индивидами.

 

Экспансию таких последовательностей, если они находятся внутри генов, медики связывают с развитием нескольких тяжелых заболеваний. По-видимому, увеличение числа повторов в ДНК вредно не само по себе, а как причина неправильного созревания (сплайсинга) матричной РНК этих генов. Развитие заболевания обычно сопровождается накоплением в ядре точечных агрегатов РНК c этими «мусорными» последовательностями. Иногда такая РНК даже транслируется в белки, что приводит к накоплению нерастворимых белковых агрегатов и приводит к гибели клеток. На уровне организма это выглядит как необратимая дистрофия мышц, отмирание периферических нейронов и так далее.

 

Причинно-следственная связь между накоплением микросаттелитов в генах и развитием тех или иных симптомов болезни пока исследована слабо и находится для большинства обсуждаемых болезней на уровне доказанной корреляции. В случае одного из типов бокового амиотрофического склероза подробнее можно почитать здесь, в случае миодистрофиии — здесь и здесь, про болезнь Хантингтона — здесь. Тем не менее, есть основания полагать, что поскольку каждое из заболеваний сопровождается накоплением агрегатов РНК в ядрах, то и устранение этих агрегатов может привести к устранению симптомов заболевания. Именно этим руководствовались авторы новой статьи, разработавшие метод устранения агрегатов и «вылечившие» с его помощью несколько клеточных культур.

 

Теоретически, устранить причину обсуждаемых заболеваний можно было бы с помощью точечного вмешательства в геном: достаточно удалить повторы, привести нужные гены в «нормальное» состояние и причина болезни будет ликвидирована. Совершенствование технологии CRISPR/Cas9 (о том, что это, можно почитать здесь) сделало эту теоретическую возможность практической опцией терапии. В некоторых случаях такой подход уже даже вышел на стадию клинических исследований.

Проблема в том, что редактирование генома подразумевает разрезание ДНК, а это чревато резким увеличением числа мутаций в клетках. Кроме того, применение даже самых точных «геномых ножниц» неизбежно приводит к возникновению лишних, нецелевых (off-target) разрезов в других местах генома, что также опасно и может сопровождаться развитием злокачественных новообразований. Обсуждение масштаба таких нецелевых разрывов при генетической терапии сейчас находится в самом разгаре, и, возможно, в реальности опасность CRISPR/Cas9 сильно преувеличена. Как бы то ни было, переход от ДНК к РНК позволяет устранить эту проблему полностью: какие бы побочные разрывы не происходили в РНК, они не отразятся на стабильности генома. Далеко не для всех болезней такой переход возможен, однако именно поэтому авторы новой статьи обратили свое внимание на те заболевания, что связаны с накоплением микросаттелитной РНК.

 

Работает новый метод следующим образом. В клетки с помощью модифицированного аденовируса вносится генетический конструкт, который содержит направляющую РНК и специализированную версию нуклеазы Cas9. Последняя не способна разрезать ДНК, т.к. в ее активном центре искусственно удалены необходимые для этого аминокислоты. Тем не менее, инактивированная нуклеаза может связываться с молекулами РНК под руководством соответствующей направляющей РНК. К модифицированной Cas9, названной авторами RСas9, также присоединена короткая РНКаза, которая уничтожает те РНК, к которым присоединяется комплекс.

 

В ходе экспериментов на клеточных линиях, в т.ч. и выделенных у пациентов с миодистрофией, ученые показали, что RСas9 действительно способна устранять агрегаты специфической для заболевания микросаттелитной РНК. Кроме того, в клетках происходить нормализация измененного при дистрофии сплайсинга (на уровне всего генома, а не отдельного гена с микросателлитами) и резко падает концентрация количество пептидов, транслированных с микросаттелитных повторов. Что касается побочных эффектов, то авторы оценили воздействие системы на нецелевые РНК как незначительное: по данным транскриптомного анализа, менее 10 различных генов изменили свой уровень экспрессии в результате применения RСas9. Отдельная часть статьи посвящена экспериментам по уменьшению размера Cas9 таким образом, чтобы получившийся конструкт можно было поместить в очень ограниченный геном вируса-носителя.

 

Устранение агрегатов микросателлитных РНК из ядер: по горизонтали разные способы окрашивания клеток (на микросателлитную РНК, на белок-нуклеазу, на ДНК вообще и наложение всех трех), по вертикали различные эксперименты с добавлением отдельных компонентов (CTG-РНК микросаттелитов, sgRNA - направляющая РНК, dCas9-PIN-HA — белок-нуклеаза). Видно, что исчезновение РНК-агрегатов происходит только в том случае (+++), когда есть все компоненты системы (NT — неправильная, несоответсвующая микросателлитам направляющая РНК). Характерно, что это происходит только в тех клетках, где прошла трансфекция, т.е. система попала внутрь клетки. Они обозначены белыми стрелками. Красными отмечены клетки, куда генетический конструкт с нуклеазой не попал, они отличаются отсутствием зеленого сигнала. (Ranjan Batra et al., Cell, 2017/ DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2017.07.010)

 

Технология редактирования генома CRISPR/Cas9 в последнее время постепенно приходит в клиническую практику. Пока большинство ученых не рискует применять ее для внесения перманентных, наследуемых изменений в геном, хотя лабораторные эксперименты в этом направлении проводятся уже не только в Китае, но и в США. Большинство методов терапии сосредоточено на внесении ненаследуемых изменений в соматические клетки либо на еще более мягкой версии метода — действия на уровне РНК. Подробнее о том, какие системы CRISPR вообще существуют и как их исследуют можно прочитать здесь.

 

N+1

#медицина

Избранное
Чтобы оставить комментарий, вам нужно авторизоваться
с помощью аккаунта в соц.сети
Читайте также

Вся Россия с пеной у рта подписывает петицию о неповышении пенсионного возраста. И, не удивлюсь, что скоро наш царь благодетель погрозит пальчиком законопроектщикам и широким жестом порвёт в прямом эфире бумажку. Но!

Вы читали содержание петиции? Там пишется, что пенсионный фонд надо восполнить не силами госкорпораций, не налогами от олигархов, не урезав зарплаты не нужным народу жирным депутатам, а, взяв в крепкий кулак малый бизнес, хорошенько его сдашекулаковить. Ведь основная часть серых зарплат приходится на него. Потому, что порой работодатель не может себе позволить платить налоги за работников. А такая временная работа бывает практически всегда спасательным кругом для тех, кто не может устроиься на работу с соцпакетом. А самозанятые? В деревне бабушка пенсионерка, получая пенсию в 15 тысяч, вынужденно подрабатывает мелким шитьем. Вот она должна от этого шитья государству, которое не может прокормить ее, хотя она 40 лет отчисляла в тот же пенсионный фонд. А куда делись ее деньги? Наверное в офшорах, или сверкают на шее губастой пизды.

Включите премодерацию комментариев
Все комментарии к этому посту будут опубликованы только после вашего подтверждения. Подробнее о премодерации